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凝胶胶内酶解技术路线
[ 来源:未知 | 作者:admin | 时间:2019-9-3 01:53:54 ]

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  凝胶胶内酶解技术路线 凝胶胶内酶解技术路线 溶于 250mL 的双蒸水中 2.脱色液:乙腈:50mM NH4HCO3=1:1 3.10mmol/LDTT 还原液:称取 0.0154g 溶于 10mL 100mM NH4HCO3 中 4.55mmol/L 烷基化溶液:称取 0.102g 碘乙酰胺溶于 10mL100mM NH4HCO3 5.酶解贮液:Trypsin(Promega,V5111)制备为 0.5μg/μL 水溶液,分装 1-3μg-20℃ 保存 6.酶解工作液:Trypsin 终浓度为 0.125μg 于 25mMNH4HCO3 溶液 7.肽提取液Ⅰ :5%TFA(v/v)水溶液 8.肽提取液Ⅱ :乙腈:5%TFA=1:1 9、考染脱色液(100ML) :乙醇 25 ml、乙酸 8 ml、水 67ml 混合 一、Hela 细胞线粒体、细胞核、胞浆的提取。 (详见各试剂盒的操作说明书) 二、蛋白质 SDS-PAGE 分离和酶切肽提取 蛋白质 SDS-PAGE 分离,每个泳道上样量为 50μ g,共 10 个泳道,恒压 100 伏。考马斯 亮蓝染色,加脱色液至无色。 电泳后样品的酶切肽提取过程如下: 1. 考马斯亮蓝染色凝胶,用解剖刀将胶带切成 1-2mm2 大小的胶片。 2. 加入脱色液(乙腈:50mM NH4CO3=1︰1)100μ L 浸泡,振荡 20min,弃去溶液,重复 1-2 次直至蓝色褪尽。 3.加入 50μ L DTT (10mmol/L) 还原液, 30min, 56℃; 弃废液, 加 100μ L 乙腈脱水 5-10min。 4.加入 50μ L 碘乙酰胺(55mmol/L)烷基化,于暗处 30min。 5.加入 100μ L 脱色液,洗 5-10min,弃废液,冰冻干燥 20min。 6.加入 15-20μ L 酶液(12.5ng/μ L) ,置于 4℃放置 30min,待酶液完全被吸收,补充酶解 缓冲液 15-20μ L,使胶完全浸没。37℃保温 15 小时或过夜。 7.加提取液Ⅰ(5%TFA)100μ L,40℃加热水浴 1 小时,30min 时,超声 3min 左右. 8. 将提取液吸到另一干净的管中, 冰冻干燥; 向胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈, 2.5%TFA)100 μ L,30℃保温 1 小时,30min 时,超声 3min 左右 9.将提取液合并,氮气吹干乙腈后,线KD 左右的蛋白条带提取液 进行混合,如 30KD-40KD,减少样本量,节约成本。 10.加入 5-10μ L 的 5%TFA 溶液混匀,质谱分析。 三、液相色谱分离和质谱鉴定 1 液相色谱条件 酶切后冻干的肤段用色谱 A 液(5%乙睛,0.1%三氟乙酸水溶液)溶解,离心后取上清,色谱 柱进样 19 川。 毛细管反相柱的色谱条件为:缓冲液有流动相 A 液组成, 洗脱液由不同比例的 流动相 A(0.1%甲酸水溶液)及流动相 B(0.1%甲酸溶于 99.9%乙睛中)组成,总时间是 120 分 钟,0 一 60 分钟,流动相中 B 比例由 5%上升至 40%;60 一 75 分钟,B 液比例由 40 一 95%; 维持巧分钟后,以 A 液平衡色谱柱 30 分钟,控制两个泵的流速使分流后流至色谱柱的流速 为 1 一 2ul/分钟。 2 质谱条件 由反相色谱流出的洗脱组分经由纳升级电喷雾接口从金属针喷出,电喷雾的电压 1.8KV;粒 子传输毛细管温度设为 180 ℃ ;质谱分析以一个全扫描 (FullMS:350-1600) 及三个分段扫描 凝胶胶内酶解技术路线 (MassRange:m/z350-700/680-1000/950-2600 模式,一级质谱采集后依次选取离子强度大的三 个离子经 CID 采集串联质谱,归一化碰撞能量为 35%;采用串联质谱扫描的动态排除功能 (Dynamicexclusion),设置排除时间是 5 分钟。 3.数据标准 由 串 联 质 谱 产 生 的 原 始 文 件 经 Xcalibur 处 理 得 到 dia 文 件 , 用 Bioworks3.O 软 件 (ThermoFirmiganTM 公司)的 sequest 进行检索, 数据库来自国际蛋白质数据索引 (International Protein Index,IPI)的 Human IPI3.24 数据库。对鉴定数据的评价采用了搜索混合数据库的 方法,首先将下载的人数据库做成反转数据库,即将人蛋白质的氨基酸序列完全倒置,而后 再与原始的人数据库结合, 从而构成混合数据库。 质谱产生的原始数据就根据构成的混合数 据库进行检索。检索后根据 Sequest 算法对不同电荷的肽段给出一系列的卡值,即 Xcorr 值。 对于每次卡值得到的肽段, 再根据倒置序列占全部肽段的比例来计算假阳性率。 根据文献报 道, 我们将假阳性率控制在 5%, 最终得到的数据卡值标准如下:Xeorr 值,1.84(+l),1.85(+2), 2.69(+3);△Cn 值大于 0.08。同时搜索反库用于评价数据可信度。检索设定肽段序列氨基酸 固定修饰为半胱氨酸(C,+57.02Da)、甲硫氨酸(M,+15.99Da),肽段质量允许误差 1.4Da, 水解酶为胰酶。

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