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生物化学与分子生物学专业论文)Ufd1增强泛素连接酶gp78活性的研
[ 来源:未知 | 作者:admin | 时间:2019-9-3 01:54:03 ]

  (生物化学与分子生物学专业论文)Ufd1增强泛素连接酶gp78活性的研究 dedecms.com

  胆固醇是哺乳动物细胞中含量最丰富的甾醇分予,其主要功能是调节质膜的流动性和相变。正常生理条件下,细胞中的胆固醇浓度被维持在比较稳定的水平。 胆固醇水平过高经常会引发多种疾病,如动脉粥样硬化、胆结石、冠心病等。因 此,生物体为维持其正常的生命活动而发展出一套精细的调控机制以维持胆固醇 的代谢平衡。胆固醇的起始性合成途径是其代谢的重要组成,该途径受细胞中胆 固醇的负反馈调控。3一羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)催化HMG CoA生成甲羟戊酸(Mevalonate),是胆固醇合成途径中关键的限速步骤,它在转 录和蛋白水平受甾醇的负反馈调控,其中甾醇促进的HMGCR的蛋白酶体降解 是胆固醇合成途径关键的反馈调控步骤。前期研究发现,gp78是HMGCR降解 过程中特异的泛素连接酶,它与内质网膜蛋白lnsig形成复合物。胆固醇合成前 体分子羊毛脂固醇(Lanoster01)能够直接促进HMGCR与Insig-gp78相结合,从而 gp78催化HMGCR泛素化,然后HMGCR通过内质网相关蛋白降解(ER.associated proteindegradation,ERAD)途径被迅速降解。为深入探索gp78介导的HMGCR 蛋白降解的分子机制,我们采用免疫共沉淀结合质谱分析,发现Ufdl是gp78 的结合蛋白,并用免疫共沉淀鉴定了它们的结合位点,体外GSTPull.down实验 证明二者直接相互作用。进一步研究发现,Ufdl通过直接结合gp78而增强后者 的泛素连接酶活性,加速HMGCR的泛素化修饰和蛋白降解。同时还发现Ufdl 对gp78泛素连接酶活性的增强作用依赖于它与泛素单体的结合。Ufdl还可以与 泛素多聚体结合并参与HMGCR泛素化修饰后的降解过程。本研究工作揭示了 Ufdl在甾醇促进的HMGCR的降解过程中能够行使双重功能,并且它能够作为 gp78的辅助因子而在内质网相关蛋白降解和胆固醇代谢平衡调控过程中发挥重 要的作用。 关键词:HMGCR:Ufdl;gp78:ERAD:泛素一蛋白酶体;泛素连接酶;E3;胆 固醇 兰州人学顾士学位论文 Abstract Cholesterolisthemostabundantsterolinmammaliancells.It mainly functions phasetransitions ofmembranes.Cholesterol maintainedatasteady levelin physiologicalconditions.Highlevelofcholesterol oftenresultsin manydiseasessuch coronaryheart disease.Therefore,animalshave developedprecise mechanismstocontrolcholesterol metabolism.Cholesterol synthesis regulatedbyfeedback inhibition.3-hydroxy-3一methlgiutarylcoenzyme Areductase (HMG CoA reductase,HMGCR),which proteindegradationcatalyzes thereductionofHMGCoAtomevalonate,arate-limitingstep inthe synthesis ofcholester01.Sterolssimulated proteasomaldegradation ofHMGCR isoneofthe regulatorypathway thatcells employ tofeedbackcontrolthe synthesis cholester01.Gp78,whichisamembrane-anchored ubiquitinligase andinteractswith lnsigcatalyses degradationofHMGCR.Theprecursorof cholesterol,lanosterol,candirectly stimulatetheinteractionbetweenHMGCRand Insig-gp78.Hence,this interaction facilitates gp78 ubiquinationreactionofHMGCRandthen,HMGCR rapidlydegradedthroughER—associated proteindegradation(ERAD).To furtherunderstandthemechanismofER-associated degradation HMGCoAreductase catalyzed gp78,weutilize coimmunoprecipitationcoupled withmass spectrometry identify印78一interactingproteins andwefoundUfdl.Next,theirbinding sites has been mappedby coimmunoprecipitation GST-pulldown assays.Further,weprovide evidenceto showthatUfdl directly interactswith gp78 andenhancesitsE3 activitythrough interaction.tMeanwhile,wehaveidentifiedthatthemono—ubiquitinbinding ofUfdl requiredfortheenhancementof gp78activity poly—ubiquitinbidingiscritical fora post—ubiquitinationstep inERAD.Ourresultsillustratethat Ufdl,as acofactor gp78,performsdualfunctionsinthe sterol-regulateddegradation ofreductaseand plays acriticalroleinER-associated proteindegradation andcholesterolmetabolism. Keywords:HMGCR;Ufdl;gp78;ERAD;ubiquitinligase;E3;cholesterol 原创性声明本人郑重声明:本人所呈交的学位论文,是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等,均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外,不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式 标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定, 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版, 允许论文被查阅和借阅;本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名:五丝 导师签名: 胆固醇(Cholesterol,图1)是哺乳动物细胞中含量最丰富的f}{醇类分子,它在生物体内发挥着极其重要的作用,是所有动物细胞生存所必需。胆固醇是极度疏 水的小分子,它的基本作用是调节质膜的流动性和相交;同时,它也是神经细胞 髓鞘的组成成分;胆固醇还是合成胆汁酸、f}{醇类激素及一些维生素的唯一前体。 研究还发现胆固醇在动物的胚胎发育中起十分重要的作用;胆固醇又和鞘磷脂在 质膜上形成一种称为rafts或cavoolae的结构而参与了信号转导【1,2】。 图1.胆固醇的结构式正常生理条件下,高等生物细胞中的胆固醇水平被维持在一个狭小的浓度范 围之内。哺乳动物体内胆固醇浓度过高或过低都将影响其正常生命过程,甚至产 生严重病变。细胞中胆固醇浓度过高可形成结晶并对细胞产生毒性作用,发育过 程中的胆固醇不足和缺失会引起智力障碍和畸形:其他疾病如:结石病、动脉粥 样硬化、Schnyder’s corneal crystalline dystrophy、Niemann—Pick C疾病、 Sitosterolemia、Smith.Lemli.Opitz综合症、阿尔海默氏疾病甚至一些肿瘤的发生 都与胆固醇直接相关。因此,生物体为维持其正常的生命活动,必须要有一套精 细的调控机制以维持胆固醇代谢的平衡。 鉴于胆固醇重要的生物功能,关于它的研究一直受到极大的重视。迄今为止 已有15位科学家因为研究胆固醇而获得诺贝尔奖,如:HeinrichWieland(1927)、 Adolf Windaus(1928)、AdolfButenandt(1939)、leopoldRuzicka(1939)、Robert Robinson(1947)及OttoDieis(1950)获得诺贝尔化学奖,是由于他们的努力使胆 固醇的化学结构得以阐明;KonradBloch和Feodor Lynen(1964)获得医学生理学 奖,因为他们阐明胆固醇生物合成的全过程;Robert B.Woodward(1965)因为胆 兰州人学硕十学位论文 固醇立体化学合成工作获得化学奖;DerekBarton和Odd Hassel(1969)获得化学 奖是建立了胆固醇的全椅式构象;JohnCornforth和Vladimir Prelog(1975)合作 定位了胆固醇分子中全部氢原子的朝向获得化学奖;以及MichaelS.Brown和 Joseph LGoldstein由于对胆固醇代谢调控的研究而获得1985年诺贝尔医学生理 胆固醇的内源起始性合成是体内胆固醇代谢平衡的最重要途径,成人每天更新的约1克胆固醇中,有2/3为自身合成获得【3】。细胞内胆固醇的合成(图2), 是以乙酰辅酶A为原料,经过约30步连续的酶促反应最终合成。其中有5个步 图2.胆固醇的合成途径骤是比较关键的。(1)甲羟戊酸(Mevalonate)是胆固醇生物合成途径中关键的 中间体,HMGCoA还原酶(HMGCR)催化HMGCoA生成Mevalonate是胆固 醇合成的限速步骤;(2)Mevalonate磷酸化和脱羧基三步反应,生成异戊酰基焦 磷酸,再一步异构化形成二甲烯丙基焦磷酸;(3)6个异戊二烯焦磷酸衍生物(二 甲烯丙基焦磷酸)发生一系列的缩合反应,生成三十碳的角鲨烯;(4)三十碳的 角鲨烯形成后,经过两步反应环化形成羊毛脂固醇(Lanoster01);(5)在胆固醇生 物合成的最后步骤中,羊毛脂固醇经过约20步反应转化为胆固醇,这些反应大 多需要NADH(或NADOH)及分子氧。 兰州大学硕士学位论文细胞通过多种途径调节胆固醇的代谢平衡。在转录水平,甾醇调节元件结合 蛋tj(sterolregulatory element bindingproteinsSREBPs)是调节胆固醇合成和吸收 的重要转录因子。SREBPs调节编码胆固醇合成途径中一些酶基因的转录,如 HMGCoA s)『】岫a辩和reduetasc【3,4b它还可以调节LDL受体(LDLR)的转录。 LDLR在受体介导的胆固醇的内吞过程中行使重要的作用。同时,SREBPs也能调 节与脂肪酸合成和吸收相关基因的表达【5,61。内质网上另一个膜蛋tjScap与 SREBPs相结合,并且协助SREBPs进入高尔基体,由位于高尔基体的SIP和¥2P 两个蛋白水解酶依次切割SREBPs前体蛋白【7-8】,释放出有转录活性NFl2-结构 域,它可进入细胞核激活靶基因的表达【9】。然而当内质网膜上的胆固醇浓度升 高时,Seap/SREBPs与另外一个膜蛋白Insig结合,导致SREBPs不能进入高尔基 体,因此与胆固醇合成相关的基因就不能被继续转录,从而降低了胆固醇的内源 合成和LDL内吞(图3)。 图3.I衄i譬调节的ffaptSRgBPs的转运 除了转录水平的调控外,对HMGCR蛋白稳定性的反馈调控是细胞胆固醇 代谢平衡调控的另一重要手段。HMGCR(图4)通过它的NH2.末端八次跨膜结 构域定位在内质网膜上【lo】,跨膜结构域的2-6区段是由称为甾醇敏感结构域 (SterolsensingDomain,SSD)【11,12,13]组成,跨膜结构域决定HMGCR的 蛋白稳定性。HMGCR的COOH-末端游离在细胞质中,并且具有全部的催化活 兰嗣大学磺士攀链论文性p4]。在富含甾醇的细胞中,HMGCR的举寿期不足lh;然而在甾孵匮乏的细 熬巾,HMGCR瓣拳寿期增长弱大终12h。 图^HMGCR的拓扑结构 魏藏辑述,HMGCR在转袋永平受SREBPs途径谡羧,该转录谖控豹巍铡已 缀研究比较清麓。然而对瑚婚GcR蛋自降解调控的研究蛊到近几年才有突破。 宋保亮博士等研究发现,HMGCR的降解调控是膜蛋白lnsig介导的泛素一蛋白 素绪合酶)、E3(泛素连接酶)的多级反威p5,16l,蓐目标蛋白共价结合,多个泛索分子技状连接,形成聚泛素链,后者被蛋白酶体识别而导致靶灏自的降解。 我爨发现甾醇类产爨(舞:25-羟疆霾酵)夔逶HMGCR熬跨貘缝檎蠛与lnsig 鬣臼相结合,该结合依赖于HMGCR第二个跨膜区中的四个氨基酸YtYFp刀。 与Insig结合后,HMGCR在第位和248位的赖氨酸上被泛素化修饰,从而被 辩熬【l习。秀终,还发理谈戆GGOH(Geranylgeranio!)瑟菲15羰豹FOH (Farnes01)可以作为内源非甾醇类产物信号增强25-羧胆固醇引起的HMGCR 的降解,以及这一作用发生禚泛素化反戚之后,提示界戊二烯化(aIlH)修饰 瓣鬃鑫参与了HMGCR夔簿黪调控(鍪5)。 进一步,利用免疫共沉淀的方法,从哺乳动物细胞的膜组分中分离出许多与 Insig相互结合的蛋白,并通道质谱鉴定出了gp78和VCP,证明它们参与了甾醇 满第盼HMGCR降解。gp78怒~静含寄多个跨貘区瓣糙,僵箕生秘擘功髓帮内 源底物都不清楚;VCP则定位于细胞质内,通过结合膜蛋白而在内质网富集, 跫知其参与了一些内质网蛋氐的降解。西眷文献报道gp78熬羧基端胞质区可结 合VCT,赢我稚研究发袋gp78瓣跨媵绥构域黎Insig相互俸焉,获蔼形成 兰州大学颈士学位论文Insig-gp78-VCP复合物。当细胞内胆固醇浓度提高时,甾醇促进HMGCR结合 Insig,将HMGCR带到lnsig-gp78一VCP复合物中,从而被gp78泛素化修饰,而 VCP则进一步识别该多聚泛素链并将HMGCR递送到蛋白酶体中进行降解(图 5)【18]。 尤为重要的是,宋保亮博士等利用体外重建系统对大量的甾醇类化合物进行 深入研究,发现胆固醇合成途径中的第一个甾醇中间体羊毛脂固醇(I.amoster01) 能够在体外直接促进HMGCR泛素化,而其它胆固醇合成中间体如Zymostcrol 等都不能促进HMGCR泛素化【19】。进而,在完整细胞体系中也证实I.amost廿'ol 能有效促进HMC-CR的泛素化修饰和降解,但与25.羟胆固醇不同的是,它对 Scap/SREBPs途径没有影响。更进一步,我们发现Lanosterol四号位上的甲基化 修饰决定了其活性和特异性。该研究工作,鉴定发现了Lanosterol为HMGCR降 解途径的内源调节小分子;揭示了一个全新的胆固醇合成调控的信号通路:在胆 固醇合成过于旺盛的时候,增多的中间体Lanosterol通过反馈促进HMGCR降解 而减少其自身的合成,由于它对SREBPs途径没有抑制,细胞仍然能够将多余的 中间体转化为终产物胆固醇,体现了生命体的经济型利用;同时还具有较强的潜 在应用价值。 图5.甾醇促进的HlVlGCR蛋白降解的分子机制 以上的研究结果显示,甾醇促进的HMGCR的蛋白降解是在内质网与细胞 兰州大学硕P学位论文 质中的多蛋白因子的共同参与下实现的。这一蛋白降解功能的正确行使,使得胆 固醇的生物合成受到严格的调控。虽然这一机制已经研究的比较深入,但是还有 许多问题亟待解决。是否还有其他内质网的膜蛋白介导了HMGCR的泛素化; HMGCR被泛素修饰后是如何被识别和降解;还有哪些蛋白因子参与了HMGCR 的降解过程等,都是尚未解决的问题。 因此,为了更深入的探索由gp78介导的HMGCR泛素化降解的分子机制, 我们采用免疫共沉淀的方法分离出gp78复合物,并且用质谱鉴定出gp78结合蛋 白Ufdl。已有研究结果表明Ufdl与VCP和Npl4三者可以形成复合物,它们在 内质网相关蛋白降解过程(ER.associatedproteindegradationERAD)中行使重要 的功能[20,21]。但是,gp78与Ufdl的相互作用并没有任何报道。迸一步免疫 共沉淀和体外GST-pulldown实验证实了二者的相互作用,并且它们的相互作用 是直接的。接下来研究发现,Ufdl通过与gp78的直接相互作用从而能够增强gp78 对HMGCR的泛素化修饰,提示Ufdl作为gp78的辅助因子增强了gp78的泛素 连接酶活性。同时还发现,Ufdl通过与泛素单体的结合增强gp78的泛素连接酶 活性。该发现是对HMGCR泛素降解分子机制的重要补充,同时揭示了一个新 的E3活性增强的分子机制。本研究工作揭示了Ufdl在甾醇促进的HMGCR的 降解过程和胆固醇代谢平衡调控过程中发挥重要的作用。这一机制的发现为寻找 新型降胆固醇药物(促进HMGCR蛋白降解)提供了可能的靶点。针对这一靶 点的药物,能够避免他汀药物只是竞争抑制酶活性而造成HMGCR蛋白代偿性 增多的药物剂量增高依赖及其引起毒性等问题,从而为治疗高胆固醇血症引起的 严重疾病提供更好的治疗手段。 兰州大学硕L学位论文仪器与试剂 材料和方法 一、主要仪器设备: PCR热循环仪和蛋白质电泳系统购自美国BIO.RAD公司;5810R低温离心 机、5415D常温高速离心机和5415R高速冷冻离心机均购自德国Eppendorf公 超高速低温冷冻离心机购自日本HITACHI公司;凝胶成像系统购自CHEMI公司;细胞培养皿购自Coming公司。 二、生化试剂与材料: 1.生化试剂 FuGENE-6购自RocheDiagnostics:Oligofectamine购自lnvitrogen:MG-132 和digitonin购自Calbiochem:25-HC购自Steraloids:泛素单体购自Steraloids; ATP购自Sigma:去脂蛋白血清(LPDS。d>1.215g/m1)是胎牛血清经过超速离心 法制各而成【22】。Ham’SF-12培养基购自GIBCO;Dulbecco’smodified Eagle,s medium(DMEM)购自Hyclone:胎牛血清(FCS)购自PAA;GlutathioneSepharose 4B 和Ni SepharoseHighperformance购自Amersham:还原型谷胱甘肽购自Sigma; 增强型化学发光系统购自PIERCE;限制性内切酶和T4DNA连接酶购自NEB。 其它试剂为国产分析纯。 2.免疫印迹所需抗体 辣根过氧化物酶标记的二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratories;T7 单克隆抗体购自Novagen;Myc单克隆抗体购自AmericanType Culture Collection;泛素单克隆抗体购自SantaCruz Biotechnology:HA单克隆抗体购自 Sigma:B-actin单克隆抗体购自Sigma;FlAG单克隆抗体购自Sigma;gp78和 HMGCR的多克隆抗体为免疫兔子获得【23】;Ufdl多克隆抗体为Dr.Yixiang Zheng(Came#e Institutionof Washington andHoward Hughes Medical Institute, Baltimore,MD)所赠。 3.实验所需质粒 兰州大学顿十学位论文pCMV-Insig-1 Myc、pCMV-HMG—Red—T7 、pEF—HA-Ubiquitin pCMV-HA—gp78(1-643)、pCMV-HA-gp78(1308)、pCMV-gp78-Myc、 pCMV-HA-Hrdl、pCMV-FLAG-Ufdl、pCMV-FLAG Ufdl(MUBMut,C92Y突变 为AA)、pCMV-FLAG-Ufdl(PUBMut,GsIVLEF突变为AAAAA)、pET28.E1、 pET28 His—Ufdl、pGEX-GST-gp78(aa308—643)、pET28一UBE2G2。Ufdl和gp78 各种缺失突变体(图6,7)都是基于其全长序列采用QuickChange(STRATAGENE) 方法获得。 G2BRVIM鼬Ufdl: “”57————————————1,_一瓣275—————————————1尸一 图7.Ufdl缺失突变体的构建图谱 兰州大学颂十学位论文主要实验方法 一、目的基因的克隆与原核表达质粒的构建 1.PCR引物设计 人Ufdl全长基因克隆引物序列: 上游引物: 5’ACG鱼鱼螋1]陀T11TrCAAC加晒TTCGAC BamHl下游引物: 5’ACG£匹薹i缝11.AGGGC兀TCTlCCr”盯3‘ Xh01 人gp78(aa.308—643)基因克隆引物序列: 上游引物: 5’ACG鱼鱼笪篁£CGAA盯陀GTcGGa“:从GAA(咒AT BamHI下游引物: XhOI2.PCR反应体系及扩增条件 PCR循环参数:94。C预变性5min后,94。C,30s;60。C,30S:72。C, 1min。循环30次后,72。C延伸5min。反应完成后,取5口l产物进行琼脂糖 凝胶电泳分析(图8,9)。 反应成份 成份原浓度 加入体积 10Buffer 5/zldN口s 2.5mM 5m Mgs04 25mM 2/zl 上游引物 10/zmol//zl 1/zl 下游引物 10/Mmol//A 模板10ng/#l 59l KODhotstat 1Uml 19l ddH20 50“l兰州人学硕士学位论文 图8.U阳l全长基因的扩增 3.PCR产物与载体的酶切 酶切体系(20/a1): 反应成份 加入体积 ddH20 11.8“l 10Xbuffer 2Ill 100BSA 0.2“l pGEX-4T3 BamHI&10I0.5&0.5叫 图9.gp78cDNA片段鹏寓码a_. 308.643)的扩增 反应成份 加入体积 ddH20 6.8/.1 10xbuffer 21.1 100BSA 0.2m PCR回收产物 109l Balnm劢oI 0.50.5正d PCR产物37。C水浴l h;载体pGEX-4T3 37。C水浴3h。酶切好的PCR产 物与pGEX-4T3经琼脂糖凝胶电泳后,回收目的条带(离心柱型DNA琼脂糖回 收试剂盒,TIANGEN)。 1)在紫外灯下将目的条带用解剖刀切下。尽量只切下目的条带,提高回收效率。 2)在电子天平上称重后,加入3倍重量体积(1ml/g)的溶胶液PN。 3)50。c水浴溶解琼脂糖。待琼脂糖完全溶解后,冷却至室温。 41将溶胶液转移至离心柱中,13000rpm离心1min。 5)向离心柱中加入700/zI的漂洗液PW,13000rpm离心1 min。 6)再向离心柱中加入500肛l的漂洗液PW,13000rpm离心1 min。 7)空柱13000 rpm离心2min,以便甩干残余的漂洗液。 8)室温晾干离心柱后,加入30/zlddH20,室温静置1min。 9)13000rpm离心1min,收集洗脱液。即为回收产物。 4.连接与转化 10l的连接体系中加入7.8肛l回收的经双酶切后的PCR产物、1/zl回收的 10 兰州大学硕十学位论文 经双酶切后的pGEX一4T3、1l10Xbuffer和0.2p1 T4DNA连接酶。4。C连接过 取该连接产物1l,360V点电击转化20pl大肠杆菌感受态DHl2S。将转化后的菌液转移到1mlLB液体培养基中,37。C恢复培养30min后。室温8000 Ipm离心1mm,弃上清。用残余的LB将菌体重悬后,涂布含氨苄青霉素的LB 平板。37。C培养12h。 5.质粒的提取与鉴定 1)将平板上生长的单克隆接种于2ml含有氨苄青霉素的LB液体培养集中。37 。C,250rpm摇床培养12h。 2)过夜培养的菌液转移到Eppendoff管中,室温,8000rpm离心1min。用线),充分振荡,将细菌重悬。 4)加入1501溶液(1%SDS,0.2mM/LNaOH),上下轻轻颠倒,直至菌液 变清。 5)加入1509l溶液(5mol/LKAcPH4.8),上下充分颠倒,使蛋白完全析出。 6)13200 rpm离心5min,将上清转移至另一加有200肛l酚:氯仿(1:1)的 Eppendoff管。 7)充分颠倒混匀。13200rpm离心5 min。 8)上清转移至另一加有1 ml无水乙醇的Eppendoff管。充分颠倒混匀。 9)13200rpm离心5min,吸干上清。沉淀用200p1的75%乙醇洗过后,13200 rpm离心1mm。 10)吸干上清。待乙醇完全挥发干后,加入30l的ddH20溶解沉淀。 所得的质粒先经双酶切(方法同PCR产物的酶切)初步鉴定后,再送交测序。 对所构建的质粒进行序列鉴定。 二、细胞培养: 中华仓鼠卵巢细胞CHO.7(Chinesehamster oval)培养于含有5%LPDS的 912/DMEM(1:1mixturcofHam’SF-12mediumandDulbecco’Smodified EaSe’S medium)培养基中。该培养基中含有100昭/ml的青霉素和100 units/mi的链霉 素。细胞培养于37。C,8-9%C02的恒温培养箱中。 兰州人学硕士学位论文 人成纤维细胞SV-589培养于含有10%FCS的DMEM(Dulbecco’Smodified Eagle’S medium)培养基中。该培养基中含有100units/ml的青霉素和100I.tg/ml 的链霉素。细胞培养于37。C,5%C02的恒温培养箱中。 三、Gp78及其相互作用蛋白的免疫沉淀: Ixl09HEK293培养于含有10%FCS的DMEM(Dulbeceo’Smodified EagIe’Smedium)培养基中。24h后收集细胞,分离膜组分。该膜组分重悬于含有 1%digitonin,5 mMEDTA5mMEGTA20ttMleupeptin,25Itg/mlALl2q,5Itg/ml pepstatinAand2 pg/mlaprotinin的PBS中。用交联gp78抗体的树脂从该重悬液 中免疫沉淀gp78。沉淀下来的蛋白从树脂上洗脱下来,进行SDS—PAGE和考马 斯亮蓝染色。蛋白条带回收并用胰蛋白酶消化后,进行质谱分析,鉴定与gp78 相互作用的蛋白。 四、原核蛋白的表达纯化: 1.接种。将构建正确的原核表达质粒转化进入表达菌株BL21。转化产物涂布 LB平板,37。C恒温培养。挑取BL21单克隆入5lnl含50/tg/ml青霉素或卡 那霉素的LB液体培养基中,37。C250 rpm摇床培养过夜。 2.放大培养。将2.5ml过夜培养的菌液接种到250ml的含有相应抗生素的LB 液体培养基中,250rpm摇床培养。 3.诱导。待ODc铂。达到0.6-0.8,加IPTG到该培养基中。IPTG终浓度为100M。 25。C,250 rpm摇床培养过夜。 4.菌体收集。将过夜培养的菌液转移到离心瓶中,4。C,6000 rpm离心10 rain。 5.超声波破茵。弃上清,细菌重悬于15ml含有0.01%NP.40的PBS(含有ImM PMSF,5lxg/mlpepstatinA,20洲leupcptin)中。超声波破菌,至菌液变清。 6.4。C,15000 rpm离心20rain后,将上清转移至一新的15ml离心管中。加 入0.5mlGlutathione或Nibeads于该上清中,室温旋转1h。 7.装柱。4。C,10009离心5min,弃上清。用预冷的PBS重悬beads,装柱。 8.用30倍柱体积预冷的PBS洗脱beads。 9.洗脱。用5ml10raM的GSH溶液洗脱,收集洗脱液。SDS.PAGE检测纯化 结果(以His.和GST-Ufdl的表达为例,图10,11)。 10.浓缩与保存。洗脱液经浓缩和定量后,保存于-80。C。 兰州大学硕L学位论文 图Io.舶s.u阳l的表达纯化 1:污导前伞菌2:诱导后伞菌3:超声后t清 4:超声后沉淀5:转完NibeadsL清 6:沈脱液。箭头所指为His-Ufdl蛋臼. 图11.GST-Ufdl的表达纯化 1:诱导前全菌2:诱导后全菌3:超声后E清 4:超声后沉淀5:转完GSTbeadsL清 6:洗脱液。箭头所指为GST-Ufdl蛋白。 五、瞬时转染与免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation): 1.CHO.7细胞以4x10'的密度接种于印mm细胞培养皿中。细胞在含有5%的 FBS的F-12/DMEM培养基中37。C培养24h。 2.转染。每个细胞培养皿转染的质粒DNA的质量为2雌。转染试剂FuGENE 体积与DNA的质量比为3:1。用F-12/DMEM将FuGENE.6稀释后,室温放置5min。该稀释液加入到转染的质粒中,室温放置15min后,以200ttl/dish 的体积加入到细胞培养皿中,轻轻混匀。 3.细胞经过培养和处理细胞收集后,用含有1%NonidctP40(v/v),5 mMEDTA 5mMEGTA20ttMleupeptin,25ttg/mlALLN,5pg/mlpepstatin A和2I^g/ml aprotinin的PBS裂解。 4.裂解液经4。C,13200rpm离心10min后,上清转移到新的1.5ml Eppendorf 5.上清中加入FLAG或Myc抗体的beads[27],4。C旋转6h。6.4。C,10009离心5min,弃上清。 7.洗3次beads后,吸干上清。加入100Ill的lxloading,100。C煮10min。 8.室温13200rpm离心一分钟后,吸取上清。对该上清进行SDS.PAGE和免疫 印迹分析。 六、GSTpull.down 兰州人学硕l:学位论史1.在每个Eppcndorf管中加入200pl含有1%Triton—X100的PBS后,再加入 GST融合蛋白和30/1的GlutathioneSepharose 4B。25。C,1000 rpm振荡1 2.4。C,1000g离心5rain,弃上清。用预冷的含有1%Triton.X100的PBS洗 3次beads。 3.向每个Eppendorf管中加入200/!用含有1%Triton—X100的PBS溶解的脱脂 奶粉,25oC,1000 vpm振荡1 4。4。C,10009离心5rain,弃上清。用预冷的含有1%Triton-X100的PBS洗3次beads。 5.在每个Eppendorf管中加入200埘含有1%Triton X100的PBS后,再加入 His重组蛋白。25。C,1000rpm振荡1h。 6.用预冷的含有1%Triton.X100的PBS洗3次beads。 7.4。C,10009离心5min,吸干上清。加入100m的lxloading,100。C煮10 rain。 8.室温13200 rpm离心一分钟后,吸取上清。对该上清进行SDS.PAGE和免疫 印迹分析。 七、体外泛素化(如Htro Ubiquitination) 100/zl反应体系中加入25 mM HepespH7A,10 mM NaCl,3mMMgCl2 0.05%TritonX一100,0.5mMDTF3mM Mg-ATP200ngE1,0.3昭UBE2G2,15 gubiquitin(ub),0.3峙gp78c(a.a.308-643)。Ufdl及其突变体的加入量如图4, 5中所示。37。C温育30min后,加入34/M1的4xloading,100。C煮10min。对 该反应产物进行SDS.PAGE和免疫印迹分析。 八、RNA干扰(RNAj) 1.SV-589以1.5xlOs的密度接种于60nlnl的细胞培养皿中。每个实验组接种4 个平行的细胞。 2.细胞再含有10%FCS的DMEM培养基中37。C培养24h。3.UfdlsiRNA的转染。化学合成的Ufdl siRNA."5’aaccttcaagtggccacctac 按照Oiigofeetamine的使用说明书的方法转染进入SV-589。4.细胞继续在37。C培养30h。细胞换成含有10%LPDS、50v.Mcompactin和 50“Mmevalonate的培养基,37oC培养16h。 14 兰州人学颂L学位论文 5.细胞换成含有10%LPDS、50I.tMcompactin和10 uMMG-132的培养基, 实验组用0.1p.g/ml25-hydroxycholesterol(25 HC)处理lh后,收集并裂解细 6.SDS.PAGE和免疫印迹分析。九、Westernmot 1.电泳。每个孔加入20l蛋白样品后,接通电源。但白样品在浓缩胶中电压 为80v,在分离胶中的电压为120V。 2.转膜。待溴酚蓝到玻璃板的前缘,断开电源。取出玻璃板,将凝胶起下,覆 盖到浸泡在转膜缓冲液的硝酸纤维素膜上。在凝胶上覆盖一张滤纸,合紧转 移装置。100V恒压通电1h。 3.封闭。转膜完成后,小心取出硝酸纤维素膜。将该膜浸泡在5%的脱脂奶粉 中,室温下摇床振荡1h。 4.一抗。封闭完成后,用TBST荡洗2次硝酸纤维素膜。倒入稀释好的一抗。 室温下摇床振荡1h或者4。C过夜。 5.用TBST洗3次膜,每次在摇床上振荡10rain。 6.二抗。倒入稀释好的二抗。室温下摇床振荡1h。 7.用TBST洗3次膜,每次在摇床上振荡10min。 8.显色。用TBS荡洗2次次硝酸纤维素膜后,将显色底物滴在硝酸纤维素膜上。 反应2min后,吸干底物。用保鲜膜包裹好膜后,暗室曝光。 兰州人学颂一I:学位论文 实验结果 实验结果与讨论 一、Ufdl是一新的gp78结合蛋白 为了鉴定与gp78相互作用的蛋白,我们制备了gp78胞质段可溶结构域的抗 体,并用经过亲和纯化的gp78的抗体从HEK-293细胞裂解液的膜组分中免疫沉 淀细胞内源的卯78。与gp78相互作用的蛋白从交联gp78抗体的树脂上洗脱下 来后,经过SDS.PAGE和考马斯亮蓝染色,可以看到不同的条带(图12A)。通 过对可见条带的质谱分析,鉴定出数个gp78结合蛋白;在鉴定出的与gp78相互 作用的蛋白中,VCP和UBE2G2(又称为ubcT)是之前已经报道过的gp78的结 合蛋白,这也表明该免疫沉淀方法是非常有效的。Ufdl(Ubiquitin fusion degradation1)被选择作为进一步研究的对象。 Ufdl最早是在酵母中通过突变筛选的方法发现的,它的突变会阻止泛素融 合蛋白的降解。已有的研究普遍认为:Ufdl与NPIA及VCP组成复合体,介导 内质网膜上被多聚泛素链修饰蛋白的识别及向蛋白酶体的转运【24,25,26,27]。 目前尚未有任何报道Ufdl与泛素连接酶具有相互作用。 为了确定Ufdl与gp78是否相互作用,我们利用免疫共沉淀的方法 (coimmunoprecipitation,Co-IP)检测内源Ufdl与gp78的相互作用。人成纤维 细胞SV-589细胞裂解液与交联gp78抗体的树脂孵育后,内源的gp78被IP下来。 在沉淀物中用anti.Ufdl的抗体检测到内源Ufdl,而阴性对照组(anti-Myc IP) 中则没有检测到Ufdl的存在(图12B)。为了进一步证实二者的相互作用,采用 瞬时转染结合Co-IP的方法口FLAG-Ufall,可以检测到HA-gp78,而另一个定 位在ER上的与gp78同源的跨膜泛素连接酶lIrdl[281则检测不到(图12C)。该 实验证实了Ufdl与gp78的相互作用,并且该相互作用具有特异性。 二、Ufdl通过258-275氨基酸区段直接与gp78相结合 已有研究表明,gp78和Ufdl都可直接与VCP(Valosin containingprotein) 结合【20】。为了检测gp78与Ufdl的相互作用是否由VCP所介导,一系列gp78 与Ufdl的缺失突变体(图6,7)用于确定它们相互作用的结构区域。将含有gp78 兰州人学颂F学位论文 (融合Myc.tag)--系歹tJ缺失突变体基因的表达质粒和含有Ufdl(融合FLAG—tag) kDa120 5l 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