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蛋白酶的提取置备和活力测定
[ 来源:未知 | 作者:admin | 时间:2019-9-3 01:54:13 ]

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  蛋白酶的提取制备和活力测定 一、 目的要求: 1、了解蛋白酶活性测定原理,并掌握测定技术; 2、通过实验加深对酶活力和比活力含义的理解 二、 原理: 采用酶活力单位数/毫克蛋白质样品表示酶的比活力。用Folin酚试剂法测定酶活力,凯氏 定氮法测定蛋白质含量。蛋白酶活力单位定为每分钟内分解出1ug酪氨酸与Folin酚试剂 作用呈兰色,其兰色深浅与酪氨酸量成正比,所以首先要作出兰色程度(用光密度值表示) 与酪氨酸深度关系的标准曲线,然后再将酶和底物反应的产物(tyr)与Folin酚试剂作用, 在分光光度计上测出光密度(OD值) ,从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸,再计 算出酶活力单位数 。 蛋白质量用克氏定氮法进行测定。 三、 器材 高速组织捣碎机;解剖刀、镊子、剪刀;量筒、吸量管、漏斗、玻棒三角烧瓶、离心管、 离心机;恒温水浴、托盘天平;比色器、分光光度计、冰箱 四、 试剂 1.25M H 2 SO 4 ;固体(NH 4 ) 2 SO 4 ;Folin酚试剂; 标准酪氨酸溶液:取预先在105℃烘至恒重的酪氨酸,称取100mg,以0.2M HCL溶液,定容 至100 mL,再加水稀释 10倍,得到100ug/ mL 的酪氨酸溶液。 酪蛋白溶液 称取酪蛋白2克,置150 mL 三角烧杯中,加入0.2M磷酸氢钠61 mL,在水浴上搅拌使溶 解,再加入39 mL 0.2M 磷酸二氢钠,得到 Ph=7的酪蛋白液,倾出上清夜备用。 0.4M三氯醋酸溶液(TCA);0.4MNa 2 CO 3 溶液 ;酚酞指示剂;标准氢氧化钠溶液 五、 操作 1、蛋白酶的制备 提取:活杀黑鱼内脏若干克,用组织捣碎机,捣碎0.5min然后混悬于两倍体积的冰冷 1.25M H 2 SO 4 液中,放入冰箱内,2h后,离心(3000 t.pm min) 、过滤,合并上清液, 即为粗蛋白酶提取液,留样测定蛋白质和酶活力。 2、蛋白酶的活力测定 Tyr 标准曲线支中试管,按下表加入酪氨酸和蒸馏水,得到一系列不同浓度 的酪氨酸溶液。混合均匀,按表依次加入试剂、保温,然后在分光光度计上比色测定 650nm 处的光密度值。以酪氨酸浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,作出标准曲线 2 3 4 5 蒸馏水(mL) 10 9 8 7 6 5 酪氨酸最后浓度 (ug/ mL) 50 混合均匀后,从上面各管各取 1毫升加入到下面各管内3、蛋白酶活力测定 按下表操作,测定光密度值 管 号 酶液 (mL) TCA (mL) 酪蛋白 (mL) TCA (mL) 酪蛋白 (mL) 滤液 (mL) Na 2 CO 3 (mL) Folin 酚试剂 (mL) OD 650 0 1 2 0 0 2 1 5 0.5 0 1 1 1 2 1 5 0.5 2 1 1 2 1 5 0.5 3 1 1 40℃ 保温 10min 2 40℃ 保温 10min 1 5 0.5 迅速 混合 40℃ 保温 20min 1、蛋白酶活力计算 酶活力光密度值,在标准曲线上查得 TYr 的 mg 数,再按下式计算酶活力单位。 酶活力(单位)= TYr 的 ug数*4/10*酶液稀释倍数。 1 1 1 1 1 1 酪氨酸溶液( mL ) 浓度(mg/ mL ) 0 10 20 30 40 50 0.4MNa 2 CO 3 ( mL ) 5 5 5 5 5 5 Folin酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 迅速混合后于40℃保温20min OD650 织梦内容管理系统

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